En 1604, Pierre Dugua, sieur de Mons, et ses compagnons, Samuel de Champlain et Jean de Biencourt de Poutrincourt, quittent la France avec une centaine d’hommes en direction de l’Amérique du Nord. Arrivés en Acadie, les colons passent leur premier hiver sur l’Île Sainte-Croix. Confrontés à de nombreuses morts dues à un environnement hostile, ils s’installent l’été suivant à Port-Royal, près de la rivière Dauphin, actuelle rivière Annapolis.
L’Habitation est construite en 1605 et sert à la traite de fourrure. Elle devient le centre d'un petit établissement français, le premier établissement européen au nord de la Floride.
Le premier hiver dans ce nouveau lieu est difficile mais les Mi’kmaqs aident à la survie des colons en leur apportant notamment de la viande fraîche et en partageant avec eux certaines techniques de survie. L’hiver suivant est encore moins meurtrier en partie grâce à l’Ordre du bon temps créé par Champlain : à tour de rôle, chacun des membres se doit de trouver du gibier et de préparer le repas.
En 1607, l’arrivée d’un navire transportant une lettre du sieur de Mons informe les colons que son monopole sur la traite des fourrures est révoqué et qu’ils doivent quitter Port-Royal. Ils sont rapatriés en France, la garde de l’Habitation est confiée à Membertou, le chef des Mi’kmaqs.
L’année suivante, le monopole du sieur de Mons est rétabli mais l’établissement français de Port-Royal reste temporairement abandonné. Cette même année, Samuel de Champlain ainsi que de nombreux colons créent un établissement plus loin sur le fleuve Saint-Laurent qui deviendra plus tard la ville de Québec.
Poutrincourt revient en Acadie en 1610 avec un groupe de colons, dont son propre fils Charles de Biencourt de Saint-Just, Claude Turgis de Saint-Étienne de La Tour et son fils Charles de Saint-Étienne de La Tour, qui a joué un grand rôle dans le développement de l’Acadie. L’abbé Jessé Fléché, un récollet, l’apothicaire Louis Hébert, le vicomte de Coulogne Thomas Robin, qui finança une partie de l’expédition, et une vingtaine d’artisans complètent l’expédition.
L’abbé convertit Membertou et sa famille. L’église joue un rôle important dans la colonisation de l’Acadie par les Français : les colons doivent évangéliser les Mi’kmaqs et l’église se charge de pourvoir aux besoins de cette conversion.
En 1613, l'Habitation est pillée et détruite par des troupes en provenance de la Virginie, mais le nom de Port-Royal survit.
Au printemps 1614, Poutrincourt, qui est alors en France, retourne une dernière fois en Acadie où il trouve la colonie en ruines. Biencourt et les La Tour, de même qu’un groupe de colons, décident d’y demeurer afin d’assurer une présence française.
En 1630, l’arrivée de familles françaises fait de la région de Port-Royal le berceau de l'Acadie. À l'époque, on entend par Port-Royal, l'ensemble des établissements acadiens s'étendant le long de la rivière Dauphin jusqu'à Paradis Terrestre (aujourd’hui Paradise).
Malgré leurs lourdes pertes, certains pionniers de l’Habitation de Port-Royal demeurent dans la région pour de nombreuses années. Un de ces pionniers, Charles de Saint-Étienne de La Tour, établit peu de temps après un poste de traite au cap de Sable.